È noto che la sindrome respiratoria acuta grave nota come malattia COVID-19, dovuta al virus SARS-CoV-2, si diffonde tramite goccioline respiratorie e contatti stretti.[1]Il carico di COVID-19 è stato estremamente grave in Lombardia e nella Pianura Padana (Nord Italia),[2] un'area caratterizzata da elevate concentrazioni di particolato, già note per produrre effetti negativi sulla salute umana.[3]I dati regionali disponibili per l'Italia alla data del 12 aprile mostrano che circa il 30% delle persone attualmente positive vive ancora in Lombardia (circa il 40% se si considerano i casi complessivamente confermati dall'inizio dell'epidemia), seguita dall'Emilia Romagna (13,5%) , Piemonte (10,5%) e Veneto (10%).[2]Queste quattro regioni della Pianura Padana rappresentano l'80% dei decessi totali registrati in Italia e il 65% dei ricoveri in Terapia Intensiva.[2]
Una ricerca condotta dalla Harvard School of Public Health sembra confermare un'associazione tra aumenti delle concentrazioni di PM e tassi di mortalità dovuti a COVID-19 negli Stati Uniti[4] In comunicazioni precedenti, abbiamo ipotizzato la possibilità che SARS-CoV-2 virus potrebbe essere presente sul particolato (PM) durante la diffusione dell'infezione,[5,6] coerentemente con le prove già
disponibile per altri virus.[7-15] Tuttavia, la questione del microbioma aereo associato al PM, specialmente negli ambienti urbani, rimane ampiamente poco studiata,[16] e – al momento – nessuno ha ancora effettuato studi sperimentali specificamente mirati alla conferma o all'esclusione della presenza del SARS-CoV-2 nelle ore pomeridiane.
Qui, presentiamo i primi risultati delle analisi che abbiamo eseguito su 34 campioni di PM10 di PM10 outdoor/airborne da un sito industriale della provincia di Bergamo, raccolti con due diversi campionatori d'aria per un periodo continuo di 3 settimane, dal 21 febbraio al marzo 13.
Seguendo la metodologia descritta da Pan et al.nel 2019 (per la raccolta, la granulometria e il rilevamento di virus aerodispersi),[17] i campioni di PM sono stati raccolti su filtri in fibra di quarzo utilizzando un campionatore d'aria gravimetrico a basso volume (38,3 l/min per 23 h), conforme al metodo di riferimento EN12341 :2014 per il monitoraggio del PM10.Il particolato è stato intrappolato sui filtri con una percentuale tipica del 99,9%.ritenzione di aerosol, opportunamente conservato e consegnato al laboratorio di Genomica Applicata e Comparata dell'Università di Trieste.Data la natura “ambientale” del campione, presumibilmente ricco di inibitori delle DNA polimerasi, si è proceduto all'estrazione dell'RNA utilizzando il kit Quick RNA fecal soil microbe adattato alla tipologia dei filtri.[18]Mezzo filtro è stato arrotolato, con il lato superiore rivolto verso l'interno,in un tubo di polipropilene da 5 ml, insieme alle sfere fornite nel kit.Dall'iniziale 1 ml di tampone di lisi, siamo stati in grado di ottenere circa 400 ul di soluzione, che è stata poi elaborata come definito dai protocolli standard, ottenendo un eluato finale di 15 ul.Successivamente, sono stati utilizzati 5 ul per il test SARS-CoV-2.Data la particolare origine del campione, è stato utilizzato il qScript XLT 1-Step RT-qPCR ToughMix.[19]I sistemi di amplificazione erano quelli del protocollo sviluppato da Corman et al, pubblicato sul sito web dell'OMS [20].
Il test era esplicitamente finalizzato a confermare o escludere la presenza dell'RNA SARS-CoV-2 sul particolato.La prima analisi ha utilizzato il “gene E” come marcatore molecolare e ha prodotto un impressionante risultato positivo su 15 filtri su 16 anche se, come ci si poteva aspettare, il Ct era compreso tra 36-38 cicli.
Successivamente, abbiamo replicato l'analisi su 6 dei filtri positivi (già positivi al “gene E”) utilizzando come marcatore molecolare il “gene RtDR” – che è altamente specifico per SARS-CoV-2 – raggiungendo 5 risultati significativi di positività;sono stati eseguiti con successo anche test di controllo per escludere false positività (Fig. 1).
Per evitare l'esaurimento dello scarso materiale di campionamento disponibile, gli RNA rimanenti estratti sono stati consegnati al locale Ospedale Universitario (uno dei centri clinici autorizzati dal Governo italiano per i test diagnostici SARS-CoV-2), al fine di eseguire un secondo test alla cieca parallela.Questo secondo laboratorio clinico ha testato 34 estrazioni di RNA per i geni E, N e RdRP, riportando 7 risultati positivi per almeno uno dei tre geni marcatori, con positività confermata separatamente per tutti e tre i marcatori (Fig. 2).Per la natura del campione, e considerato che il prelievo non è stato effettuato per finalità diagnostiche cliniche ma per prove di inquinamento ambientale (tenendo anche conto che i filtri sono stati stoccati per almeno quattro settimane prima di essere sottoposti ad analisi genetiche molecolari, comeconseguenza della chiusura italiana), possiamo confermare di aver ragionevolmente dimostrato la presenza di RNA virale SARS-CoV-2 rilevando il “gene RtDR” altamente specifico su 8 filtri.Tuttavia, a causa della mancanza di materiali aggiuntivi dai filtri, non siamo stati in grado di ripetere un numero sufficiente di test per mostrare contemporaneamente la positività per tutti e 3 i marcatori molecolari.
Questa è la prima evidenza preliminare che SARS-CoV-2 RNA può essere presente su particolato esterno, suggerendo quindi che, in condizioni di stabilità atmosferica e alte concentrazioni di PM, SARS-CoV-2 potrebbe creare cluster con PM esterno e - da riducendo il loro coefficiente di diffusione – migliorano la persistenza del virus nell'atmosfera.Ulteriori conferme di questo preliminarele prove sono in corso e dovrebbero includere una valutazione in tempo reale sulla vitalità del SARS-CoV-2 e sulla sua virulenza quando adsorbito sul particolato.Allo stato attuale, non è possibile formulare ipotesi sulla correlazione tra la presenza del virus sulla PM e la progressione dell'epidemia di COVID-19.Altre questioni da affrontare in modo specifico sono le concentrazioni medie di PM alla finenecessarie per un potenziale “effetto boost” del contagio (nel caso in cui si confermi che il PM possa agire da “carrier” per i nuclei delle goccioline virali), o anche la teorica possibilità di immunizzazione conseguente a esposizioni a dosi minime a soglie inferiori di PM .
Fig.1 Curve di amplificazione dei geni E (A) e RdRP (B): le linee verdi rappresentano i filtri testati;linee incrociaterappresenta le estrazioni del filtro di riferimento;le linee rosse rappresentano l'amplificazione dei campioni positivi.
Fig.2.Risultati positivi (contrassegnati con X) per i geni E, N e RdRP ottenuti per tutti i 34 campioni PM10filtri testati nella seconda analisi parallela.
Leonardo Setti1, Fabrizio Passarini2, Gianluigi De Gennaro3, Pierluigi Barbieri4, Maria Grazia Perrone5, Massimo Borelli6, Jolanda Palmisani3, Alessia Di Gilio3, Valentina Torboli6, Alberto Pallavicini6, Maurizio Ruscio7, Prisco Piscitelli8, Alessandro Miani8,9
1. Dipartimento di Chimica Industriale, Università di Bologna, Viale del Risorgimento – 4, I-40136, Bologna, Italia
e-mail: leonardo.setti@unibo.it
2. Centro Interdipartimentale per la Ricerca Industriale “Fonti Rinnovabili, Ambiente, Crescita Blu, Energia”,
University of Bologna, Rimini, Italy e-mail: fabrizio.passarini@unibo.it
3. Dipartimento di Biologia, Università “Aldo Moro” di Bari, Bari, Italia
e-mail: gianluigi.degennaro@uniba.it; alessia.digilio@uniba.it; jolanda.palmisani@uniba.it
4. Dipartimento di Scienze Chimiche e Farmaceutiche, Università di Trieste, Trieste, Italia
e-mail: barbierp@units.it
5. Divisione Ricerca Ambientale, TCR TECORA, Milano, Italia
e-mail: mariagrazia.perrone@tcrtecora.com
6. Dipartimento di Scienze della Vita – Università di Trieste, Trieste, Italia
e-mail: borelli@units.it; torboli@units.it; pallavic@units.it
7. Divisione di Medicina di Laboratorio, Azienda Ospedaliera Universitaria Giuliano Isontina (ASU GI), Trieste, Italia
email: maurizio.ruscio@asugi.sanita.fvg.it
8. Società Italiana di Medicina Ambientale (SIMA), Milano, Italia
e-mail: priscofreedom@hotmail.com; alessandro.miani@unimi.it
9. Dipartimento di Scienze e Politiche Ambientali, Università degli Studi di Milano, Milano, Italia
e-mail: priscofreedom@hotmail.com; alessandro.miani@unimi.it
Autore corrispondente:
Leonardo Setti, Department of Industrial Chemistry, University of Bologna Viale del Risorgimento 4, 40136, Bologna, Italy; e-mail: leonardo.setti@unibo.it
Riferimenti
1. Organizzazione mondiale della sanità, Modalità di trasmissione del virus che causa COVID-19: implicazioni per le raccomandazioni precauzionali dell'IPC, Riassunto scientifico;disponibile su: https://www.who.int/newsroom/commentaries/detail/modes-of-transmission-of-virus-causing-covid-19-implications-for-ipcprecaution-recommendations (29 marzo 2020)
2. Ministero della Salute, bollettino quotidiano Focolaio di Covid-19 in Italia, disponibile all'indirizzo http://www.salute.gov.it/imgs/C_17_notizie_4451_0_file.pdf
3. AEA, Agenzia europea dell'ambiente, rapporto 2019 sulla qualità dell'aria in Europa;n. 10/2019;Agenzia europea dell'ambiente: Copenaghen, Danimarca, disponibile su: https://www.eea.europa.eu/publications/airquality-in-europe-2019
4. Xiao Wu, Rachel C. Nethery, M. Benjamin Sabath, Danielle Braun, Francesca Dominici, Esposizione all'inquinamento atmosferico e mortalità da COVID-19 negli Stati Uniti, disponibile all'indirizzo: https://projects.iq.harvard.edu/ files/covid-pm/files/pm_and_covid_mortality.pdf
5. Società Italiana di Medicina Ambientale (SIMA), Position Paper Particulate Matter and COVID-19,
disponibile su: http://www.simaonlus.it/wpsima/wp-content/uploads/2020/03/COVID_19_positionpaper_ITA.pdf
6. Setti L., Passarini F., De Gennaro G., Barbieri P., Perrone MG, Piazzalunga A., Borelli M., Palmisani J., Di Gilio A, Piscitelli P, Miani A., Is there a Plausible Role for Particulate Matter in the spreading of COVID-19 in Northern Italy?, BMJ Rapid Responses, 8 aprile 2020, disponibile su: https://www.bmj.com/content/368/bmj.m1103/rapid-responses
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Originale: https://doi.org/10.1101/2020.04.15.20065995
Tempo di pubblicazione: 18 aprile 2020