Ernstig acuut respiratoir syndroom, bekend als de ziekte van COVID-19 – als gevolg van het SARS-CoV-2-virus – wordt verspreid via ademhalingsdruppels en nauwe contacten.[1]De last van COVID-19 was extreem zwaar in Lombardije en de Povlakte (Noord-Italië),[2] een gebied dat wordt gekenmerkt door hoge concentraties fijnstof, waarvan al bekend is dat ze negatieve effecten hebben op de menselijke gezondheid.[3]Regionale cijfers beschikbaar voor Italië op de datum van 12 april laten zien dat ongeveer 30% van de momenteel positieve mensen nog steeds in Lombardije woont (ongeveer 40% als rekening wordt gehouden met het totale aantal bevestigde gevallen vanaf het begin van de epidemie), gevolgd door Emilia Romagna (13,5%) , Piemonte (10,5%) en Veneto (10%).[2]Deze vier regio's van de Po-vallei zijn goed voor 80% van het totale aantal sterfgevallen in Italië en 65% van de opnames op Intensive Care Units.[2]
Een onderzoek uitgevoerd door de Harvard School of Public Health lijkt een verband te bevestigen tussen toename van PM-concentraties en sterftecijfers als gevolg van COVID-19 in de VS[4]. In eerdere mededelingen hebben we de mogelijkheid verondersteld dat SARS-CoV-2 virus aanwezig kan zijn op fijnstof (PM) tijdens de verspreiding van de infectie,[5,6] in overeenstemming met het reeds bestaande bewijs
beschikbaar voor andere virussen. [7-15] De kwestie van PM-geassocieerd microbioom in de lucht, vooral in stedelijke omgevingen, blijft echter grotendeels onderbelicht [16] en – op dit moment – heeft niemand nog experimentele studies uitgevoerd die specifiek gericht zijn op bij het bevestigen of uitsluiten van de aanwezigheid van SARS-CoV-2 op PM.
Hier presenteren we de eerste resultaten van de analyses die we hebben uitgevoerd op 34 PM10-monsters van PM10 buitenshuis/in de lucht van een industriële locatie in de provincie Bergamo, verzameld met twee verschillende luchtmonsternemers gedurende een ononderbroken periode van 3 weken, van 21 februari tot maart 13e.
Volgens de methode beschreven door Pan et al.in 2019 (voor de verzameling, deeltjesgroottebepaling en detectie van virussen in de lucht)[17] werden PM-monsters verzameld op kwartsvezelfilters met behulp van een gravimetrische luchtmonsternemer met laag volume (38,3 l/min gedurende 23 uur), in overeenstemming met de referentiemethode EN12341 :2014 voor PM10-bewaking.Fijnstof werd met 99,9% typisch op filters gevangenaërosolretentie, op de juiste manier opgeslagen en afgeleverd bij het laboratorium van Applied and Comparative Genomics van de Universiteit van Triëst.Gezien de "milieu"-aard van het monster, vermoedelijk rijk aan remmers van DNA-polymerasen, gingen we verder met de extractie van RNA met behulp van de Quick RNA fecale bodemmicrobe kit aangepast aan het type filters.[18]Halffilter gerold, met de bovenzijde naar binnen gericht,in een polypropyleen tube van 5 ml, samen met de korrels in de kit.Van de aanvankelijke 1 ml lysisbuffer waren we in staat om ongeveer 400 µl oplossing te krijgen, die vervolgens werd verwerkt zoals gedefinieerd door de standaardprotocollen, resulterend in een uiteindelijk eluaat van 15 µl.Vervolgens werd 5 ul gebruikt voor de SARS-CoV-2-test.Gezien de specifieke oorsprong van het monster, werd de qScript XLT 1-Step RT-qPCR ToughMix gebruikt.De amplificatiesystemen waren die van het protocol ontwikkeld door Corman et al, gepubliceerd op de WHO-website [20].
De test was expliciet gericht op het bevestigen of uitsluiten van de aanwezigheid van het SARS-CoV-2 RNA op fijnstof.De eerste analyse gebruikte het "E-gen" als een moleculaire marker en leverde een indrukwekkend positief resultaat op bij 15 van de 16 filters, zelfs als, zoals we konden verwachten, de Ct tussen 36-38 cycli lag.
Daarna hebben we de analyse gerepliceerd op 6 van de positieve filters (reeds positief voor "E-gen") door het "RtDR-gen" te gebruiken als een moleculaire marker - die zeer specifiek is voor SARS-CoV-2 - waarbij we 5 significante resultaten hebben behaald van positiviteit;controletests om valse positiviteit uit te sluiten werden ook met succes uitgevoerd (fig. 1).
Om te voorkomen dat het schaarse beschikbare monstermateriaal opraakt, werden de resterende geëxtraheerde RNA's afgeleverd bij het plaatselijke universitaire ziekenhuis (een van de klinische centra die door de Italiaanse regering zijn geautoriseerd voor SARS-CoV-2 diagnostische tests), om een tweede parallelle blinde test.Dit tweede klinische laboratorium testte 34 RNA-extracties voor de E-, N- en RdRP-genen en rapporteerde 7 positieve resultaten voor ten minste één van de drie merkergenen, waarbij positiviteit afzonderlijk werd bevestigd voor alle drie de merkers (Fig. 2).Vanwege de aard van het monster, en gezien het feit dat de monsterneming niet is uitgevoerd voor klinische diagnostische doeleinden, maar voor milieuverontreinigingstests (ook rekening houdend met het feit dat de filters gedurende ten minste vier weken werden opgeslagen voordat ze moleculair genetische analyses ondergingen, aangezienals gevolg van de Italiaanse sluiting), kunnen we bevestigen dat we de aanwezigheid van SARS-CoV-2 viraal RNA redelijkerwijs hebben aangetoond door het zeer specifieke "RtDR-gen" op 8 filters te detecteren.Vanwege het ontbreken van aanvullende materialen van de filters, waren we echter niet in staat om voldoende tests te herhalen om positiviteit voor alle 3 de moleculaire markers tegelijk aan te tonen.
Dit is het eerste voorlopige bewijs dat SARS-CoV-2-RNA aanwezig kan zijn op fijnstof buitenshuis, wat suggereert dat SARS-CoV-2 in omstandigheden van atmosferische stabiliteit en hoge concentraties PM clusters zou kunnen vormen met PM buitenshuis en – door hun diffusiecoëfficiënt verminderen - de persistentie van het virus in de atmosfeer verbeteren.Verdere bevestigingen van deze voorlopigeer is nog steeds bewijs en het zou een realtime beoordeling moeten omvatten van de vitaliteit van SARS-CoV-2 en de virulentie ervan wanneer het wordt geadsorbeerd op fijn stof.Op dit moment kunnen er geen aannames worden gedaan over de correlatie tussen de aanwezigheid van het virus op PM en de voortgang van de COVID-19-uitbraak.Andere kwesties die specifiek moeten worden aangepakt, zijn de gemiddelde concentraties PM uiteindelijkvereist voor een mogelijk "boost-effect" van de besmetting (in het geval wordt bevestigd dat PM zou kunnen werken als een "drager" voor de virale druppelkernen), of zelfs de theoretische mogelijkheid van immunisatie als gevolg van blootstelling aan minimale doses bij lagere PM-drempels .
Fig.1 Amplificatiecurven van E (A) en RdRP-genen (B): groene lijnen vertegenwoordigen geteste filters;lijnen kruisenvertegenwoordigt referentiefilterextracties;rode lijnen vertegenwoordigen de versterking van de positieve monsters.
Fig. 2.Positieve resultaten (gemarkeerd met X) voor E-, N- en RdRP-genen verkregen voor alle 34 PM10-monstersfilters getest in de tweede parallelle analyses.
Leonardo Setti1, Fabrizio Passarini2, Gianluigi De Gennaro3, Pierluigi Barbieri4, Maria Grazia Perrone5, Massimo Borelli6, Jolanda Palmisani3, Alessia Di Gilio3, Valentina Torboli6, Alberto Pallavicini6, Maurizio Ruscio7, Prisco Piscitelli8, Alessandro Miani8,9
1. Afdeling Industriële Chemie, Universiteit van Bologna, Viale del Risorgimento – 4, I-40136, Bologna, Italië
e-mail: leonardo.setti@unibo.it
2. Interdepartementaal Centrum voor Industrieel Onderzoek "Hernieuwbare bronnen, milieu, blauwe groei, energie",
University of Bologna, Rimini, Italy e-mail: fabrizio.passarini@unibo.it
3. Afdeling Biologie, Universiteit “Aldo Moro” van Bari, Bari, Italië
e-mail: gianluigi.degennaro@uniba.it; alessia.digilio@uniba.it; jolanda.palmisani@uniba.it
4. Afdeling Chemische en Farmaceutische Wetenschappen, Universiteit van Triëst, Triëst, Italië
e-mail: barbierp@units.it
5. Afdeling Milieuonderzoek, TCR TECORA, Milaan, Italië
e-mail: mariagrazia.perrone@tcrtecora.com
6. Afdeling Life Sciences – Universiteit van Triëst, Triëst, Italië
e-mail: borelli@units.it; torboli@units.it; pallavic@units.it
7. Afdeling Laboratoriumgeneeskunde, Universitair Ziekenhuis Giuliano Isontina (ASU GI), Triëst, Italië
email: maurizio.ruscio@asugi.sanita.fvg.it
8. Italian Society of Environmental Medicine (SIMA), Milaan, Italië
e-mail: priscofreedom@hotmail.com; alessandro.miani@unimi.it
9. Afdeling Milieukunde en Poicy, Universiteit van Milaan, Milaan, Italië
e-mail: priscofreedom@hotmail.com; alessandro.miani@unimi.it
Corresponderende auteur:
Leonardo Setti, Department of Industrial Chemistry, University of Bologna Viale del Risorgimento 4, 40136, Bologna, Italy; e-mail: leonardo.setti@unibo.it
Referenties
1. Wereldgezondheidsorganisatie, Wijzen van overdracht van het virus dat COVID-19 veroorzaakt: implicaties voor IPC-voorzorgsaanbevelingen, Wetenschappelijk overzicht;beschikbaar op: https://www.who.int/newsroom/commentaries/detail/modes-of-transmission-of-virus-causing-covid-19-implications-for-ipcprecaution-recommendations (29 maart 2020)
2. Italiaans Ministerie van Volksgezondheid, dagelijks bulletin Covid-19-uitbraak in Italië, beschikbaar op http://www.salute.gov.it/imgs/C_17_notizie_4451_0_file.pdf
3. EEA, Europees Milieuagentschap, Air Quality in Europe 2019 Report;nr. 10/2019;Europees Milieuagentschap: Kopenhagen, Denemarken, beschikbaar op: https://www.eea.europa.eu/publications/airquality-in-europe-2019
4. Xiao Wu, Rachel C. Nethery, M. Benjamin Sabath, Danielle Braun, Francesca Dominici, Exposure to luchtverontreiniging en COVID-19-mortaliteit in de Verenigde Staten, beschikbaar op: https://projects.iq.harvard.edu/ files/covid-pm/files/pm_and_covid_mortality.pdf
5. Italian Society of Environmental Medicine (SIMA), Position Paper Particulate Matter en COVID-19,
beschikbaar op: http://www.simaonlus.it/wpsima/wp-content/uploads/2020/03/COVID_19_positionpaper_ENG.pdf
6. Setti L., Passarini F., De Gennaro G., Barbieri P., Perrone MG, Piazzalunga A., Borelli M., Palmisani J., Di Gilio A, Piscitelli P, Miani A., Is er een plausibele rol for Particulate Matter in the spreading of COVID-19 in Northern Italy?, BMJ Rapid Responses, 8 april 2020, beschikbaar op: https://www.bmj.com/content/368/bmj.m1103/rapid-responses
7. Sedlmaier, N., Hoppenheidt, K., Krist, H., Lehmann, S., Lang, H., Buttner, M. Generatie van vogelgriepvirus (AIV) verontreinigde fecale fijne deeltjes (PM2.5): genoom- en besmettelijkheidsdetectie en immissieberekening.Veterinaire Microbiologie.139, 156-164 (2009)
8. Zhao, Y., Richardson, B., Takle, E., Chai, L., Schmitt, D., Win, H. Transmissie via de lucht kan een rol hebben gespeeld bij de verspreiding van hoogpathogene vogelgriepuitbraken in 2015 in de Verenigde Staten.Wetenschappelijk Rep. 9, 11755. https://doi.org/10.1038/s41598-019-47788-z (2019)
9. Ma, Y., Zhou, J., Yang, S., Zhao, Y., Zheng, X. Beoordeling van de impact van stofgebeurtenissen op de incidentie van mazelen in West-China.Atmosferische omgeving.157, 1-9 (2017)
10. Sorensen, JH, Mackay, DKJ, Jensen, C. Ø., Donaldson, AI Een geïntegreerd model om de atmosferische verspreiding van mond- en klauwzeervirus Epidemiol te voorspellen.Infecteren., 124, 577-590 (2000)
11. Glostera, J., Alexandersen, S. Nieuwe richtingen: overdracht via de lucht van het mond- en klauwzeervirus Atmosferische omgeving, 38 (3), 503-505 (2004)
12. Reche, I., D'Orta, G., Mladenov, N., Winget, DM, Suttle, CA Afzettingssnelheden van virussen en bacteriën boven de atmosferische grenslaag.Het ISME-journaal.12, 1154-1162 (2018)
13. Qin, N., Liang, P., Wu, C., Wang, G., Xu, Q., Xiong, X., Wang, T., Zolfo, M., Segata, N., Qin, H ., Knight, R., Gilbert, JA, Zhu, TF Longitudinaal onderzoek van het microbioom geassocieerd met fijn stof in een megastad.Genoom Biologie.21, 55 (2020)
14. Zhao, Y., Richardson, B., Takle, E., Chai, L., Schmitt, D., Win, H. Transmissie via de lucht kan
speelde een rol bij de verspreiding van hoogpathogene aviaire influenza-uitbraken in 2015 in de Verenigde Staten.Wetenschap
Rep. 9, 11755. https://doi.org/10.1038/s41598-019-47788-z (2019)
15. Ma, Y., Zhou, J., Yang, S., Zhao, Y., Zheng, X. Beoordeling van de impact van stofgebeurtenissen op de incidentie van mazelen in West-China.Atmosferische omgeving.157, 1-9 (2017)
16. Jiang, W., Laing, P., Wang, B., Fang, J., Lang, J., Tian, G., Jiang, J., Zhu, TF Geoptimaliseerde DNA-extractie en metagenomische sequentiebepaling van microbiële gemeenschappen in de lucht .Nat.Protocol.10, 768-779 (2015)
17. Pan, M., Lednicky, JA, Wu, C.-Y., Verzameling, deeltjesgroottebepaling en detectie van virussen in de lucht.Journal of Applied Microbiology, 127, 1596-1611 (2019)
18. Zymoresearch Ldt, productbeschrijving, beschikbaar op: https://www.zymoresearch.com/products/quick-rnafecal-soil-microbe microprep-kit
19. Quantabio Ltd, beschrijving van het product, beschikbaar op: https://www.quantabio.com/qscript-xlt-1-steprt-qpcr-toughmix
20. Corman, VM, Landt, O., Kaiser, M., Molenkamp, R., Meijer, A., Chu, DK, & Mulders, DG (2020).
Detectie van het nieuwe coronavirus 2019 (2019-nCoV) door real-time RT-PCR.Eurosurveillance, 25(3), beschikbaar op:.https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6988269/
Origineel: https://doi.org/10.1101/2020.04.15.20065995
Posttijd: 18 april 2020