Alvorlig akutt respiratorisk syndrom kjent som COVID-19 sykdom – på grunn av SARS-CoV-2 virus – er kjent for å spre seg via luftveisdråper og nære kontakter.[1]Belastningen av COVID-19 var ekstremt alvorlig i Lombardia og Po-dalen (Nord-Italia),[2] et område preget av høye konsentrasjoner av svevestøv, som allerede er kjent for å gi negative effekter på menneskers helse.[3]Regionale tall som er tilgjengelige for Italia på datoen 12. april viser at omtrent 30 % av de for tiden positive mennesker fortsatt bor i Lombardia (omtrent 40 % hvis man tar i betraktning de totale tilfellene bekreftet fra begynnelsen av epidemien), etterfulgt av Emilia Romagna (13,5 %) , Piemonte (10,5%) og Veneto (10%).[2]Disse fire regionene i Po-dalen står for 80 % av de totale dødsfallene registrert i Italia og 65 % av innleggelsene på intensivavdelinger.[2]
En forskning utført av Harvard School of Public Health ser ut til å bekrefte en sammenheng mellom økninger i PM-konsentrasjoner og dødelighet på grunn av COVID-19 i USA[4] I tidligere kommunikasjoner har vi antatt muligheten for at SARS-CoV-2 virus kan være tilstede på partikulært materiale (PM) under spredningen av infeksjonen, [5,6] i samsvar med bevis allerede
tilgjengelig for andre virus.[7-15] Spørsmålet om luftbåren PM-assosiert mikrobiom, spesielt i urbane miljøer, er imidlertid stort sett lite undersøkt,[16] og – for tiden – har ingen fortsatt utført eksperimentelle studier spesielt rettet mot ved å bekrefte eller ekskludere tilstedeværelsen av SARS-CoV-2 på PM.
Her presenterer vi de første resultatene av analysene som vi har utført på 34 PM10-prøver av utendørs/luftbåren PM10 fra et industriområde i Bergamo-provinsen, samlet med to forskjellige luftprøvetakere over en sammenhengende 3-ukers periode, fra 21. februar til mars. 13.
Etter metodikken beskrevet av Pan et al.i 2019 (for innsamling, partikkelstørrelse og påvisning av luftbårne virus),[17] ble PM-prøver samlet inn på kvartsfiberfiltre ved å bruke en gravimetrisk luftprøvetaker med lavt volum (38,3 l/min i 23 timer), i samsvar med referansemetoden EN12341 :2014 for PM10-overvåking.Partikulært materiale ble fanget på filtre med 99,9 % typiskaerosolretensjon, riktig lagret og levert til laboratoriet for Applied and Comparative Genomics ved Trieste University.Gitt den "miljømessige" naturen til prøven, antagelig rik på inhibitorer av DNA-polymeraser, fortsatte vi med ekstraksjonen av RNA ved å bruke Quick RNA fecal jord mikrobe kit tilpasset typen filtre.[18]Halvfilteret ble rullet, med oversiden vendt innover,i et 5 ml polypropylenrør, sammen med perlene som følger med i settet.Fra den første 1 ml lysisbuffer var vi i stand til å få ca. 400 ul løsning, som deretter ble behandlet som definert av standardprotokollene, noe som resulterte i et endelig eluat på 15 ul.Deretter ble 5 ul brukt til SARS-CoV-2-testingen.Gitt den spesielle opprinnelsen til prøven, ble qScript XLT 1-Step RT-qPCR ToughMix brukt.[19]Amplifikasjonssystemene var de i protokollen utviklet av Corman et al, publisert på WHOs nettsted [20].
Testen var eksplisitt rettet mot å bekrefte eller ekskludere tilstedeværelsen av SARS-CoV-2 RNA på svevestøv.Den første analysen brukte "E-genet" som en molekylær markør og ga et imponerende positivt resultat på 15 av 16 filtre selv om, som vi kunne forvente, Ct var mellom 36-38 sykluser.
Etter det har vi replikert analysen på 6 av de positive filtrene (allerede positive til "E-genet") ved å bruke "RtDR-genet" som en molekylær markør - som er svært spesifikk for SARS-CoV-2 - og nådde 5 signifikante resultater av positivitet;kontrolltester for å utelukke falsk positivitet ble også utført med suksess (fig. 1).
For å unngå å gå tom for det knappe prøvematerialet som var tilgjengelig, ble de gjenværende ekstraherte RNAene levert til det lokale universitetssykehuset (et av de kliniske sentrene som er autorisert av den italienske regjeringen for SARS-CoV-2 diagnostiske tester), for å utføre en ny parallell blindtest.Dette andre kliniske laboratoriet testet 34 RNA-ekstraksjoner for E-, N- og RdRP-genene, og rapporterte 7 positive resultater for minst ett av de tre markørgenene, med positivitet bekreftet separat for alle de tre markørene (fig. 2).På grunn av prøvens art, og tatt i betraktning at prøvetakingen ikke har blitt utført for klinisk diagnostiske formål, men for miljøforurensningstester (også tatt i betraktning at filtre ble lagret i minst fire uker før de gjennomgikk molekylærgenetiske analyser, somen konsekvens av den italienske nedleggelsen), kan vi bekrefte å ha påvist tilstedeværelsen av SARS-CoV-2 viralt RNA med rimelighet ved å påvise svært spesifikt "RtDR-gen" på 8 filtre.På grunn av mangelen på tilleggsmaterialer fra filtrene, var vi imidlertid ikke i stand til å gjenta nok antall tester til å vise positivitet for alle de 3 molekylære markørene samtidig.
Dette er det første foreløpige beviset på at SARS-CoV-2 RNA kan være tilstede på utendørs partikler, og antyder dermed at SARS-CoV-2 under forhold med atmosfærisk stabilitet og høye konsentrasjoner av PM kan skape klynger med utendørs PM og – ved redusere diffusjonskoeffisienten deres – forbedrer virusets persistens i atmosfæren.Ytterligere bekreftelser av denne foreløpigebevis pågår, og bør inkludere sanntidsvurdering av vitaliteten til SARS-CoV-2 så vel som dens virulens når den adsorberes på partikler.Foreløpig kan det ikke gjøres noen antagelser om sammenhengen mellom tilstedeværelsen av viruset på PM og progresjon av covid-19-utbrudd.Andre problemer som må tas opp spesifikt er de gjennomsnittlige konsentrasjonene av PM til sluttnødvendig for en potensiell "boost-effekt" av smitten (i tilfelle det er bekreftet at PM kan fungere som en "bærer" for de virale dråpekjernene), eller til og med den teoretiske muligheten for immunisering som følge av minimal doseeksponering ved lavere terskler for PM .
Fig. 1 Amplifikasjonskurver for E (A) og RdRP gener (B): grønne linjer representerer testede filtre;krysse linjerrepresenterer referansefilterekstraksjoner;røde linjer representerer amplifikasjonen av de positive prøvene.
Fig.2.Positive resultater (merket med X) for E-, N- og RdRP-gener oppnådd for alle 34 PM10-prøvenefiltre testet i den andre parallellanalysen.
Leonardo Setti1, Fabrizio Passarini2, Gianluigi De Gennaro3, Pierluigi Barbieri4, Maria Grazia Perrone5, Massimo Borelli6, Jolanda Palmisani3, Alessia Di Gilio3, Valentina Torboli6, Alberto Pallavicini6, Maurizio Ruscio7, Prisco Piscitelli8, A9andro
1. Institutt for industriell kjemi, Universitetet i Bologna, Viale del Risorgimento – 4, I-40136, Bologna, Italia
e-mail: leonardo.setti@unibo.it
2. Tverdepartementalt senter for industriforskning "Fornybare kilder, miljø, blå vekst, energi",
University of Bologna, Rimini, Italy e-mail: fabrizio.passarini@unibo.it
3. Institutt for biologi, Universitetet "Aldo Moro" i Bari, Bari, Italia
e-mail: gianluigi.degennaro@uniba.it; alessia.digilio@uniba.it; jolanda.palmisani@uniba.it
4. Institutt for kjemiske og farmasøytiske vitenskaper, Universitetet i Trieste, Trieste, Italia
e-mail: barbierp@units.it
5. Avdeling for miljøforskning, TCR TECORA, Milano, Italia
e-mail: mariagrazia.perrone@tcrtecora.com
6. Institutt for biovitenskap – Universitetet i Trieste, Trieste, Italia
e-mail: borelli@units.it; torboli@units.it; pallavic@units.it
7. Avdeling for laboratoriemedisin, Universitetssykehuset Giuliano Isontina (ASU GI), Trieste, Italia
email: maurizio.ruscio@asugi.sanita.fvg.it
8. Italian Society of Environmental Medicine (SIMA), Milano, Italia
e-mail: priscofreedom@hotmail.com; alessandro.miani@unimi.it
9. Institutt for miljøvitenskap og poicy, Universitetet i Milano, Milano, Italia
e-mail: priscofreedom@hotmail.com; alessandro.miani@unimi.it
Tilsvarende forfatter:
Leonardo Setti, Department of Industrial Chemistry, University of Bologna Viale del Risorgimento 4, 40136, Bologna, Italy; e-mail: leonardo.setti@unibo.it
Referanser
1. Verdens helseorganisasjon, overføringsmåter for virus som forårsaker COVID-19: implikasjoner for IPCs forholdsregler, vitenskapelig orientering;tilgjengelig på: https://www.who.int/newsroom/commentaries/detail/modes-of-transmission-of-virus-causing-covid-19-implications-for-ipcprecaution-recommendations (29. mars 2020)
2. Det italienske helsedepartementet, daglig bulletin Covid-19-utbruddet i Italia, tilgjengelig på http://www.salute.gov.it/imgs/C_17_notizie_4451_0_file.pdf
3. EEA, European Environmental Agency, Air Quality in Europe 2019-rapport;nr. 10/2019;European Environment Agency: København, Danmark, tilgjengelig på: https://www.eea.europa.eu/publications/airquality-in-europe-2019
4. Xiao Wu, Rachel C. Nethery, M. Benjamin Sabath, Danielle Braun, Francesca Dominici, Exposure to air pollution and COVID-19 mortality in the United States, tilgjengelig på: https://projects.iq.harvard.edu/ files/covid-pm/files/pm_and_covid_mortality.pdf
5. Italian Society of Environmental Medicine (SIMA), posisjonspapir Particulate Matter og COVID-19,
tilgjengelig på: http://www.simaonlus.it/wpsima/wp-content/uploads/2020/03/COVID_19_positionpaper_ENG.pdf
6. Setti L., Passarini F., De Gennaro G., Barbieri P., Perrone MG, Piazzalunga A., Borelli M., Palmisani J., Di Gilio A, Piscitelli P, Miani A., Er det en plausibel rolle for Particulate Matter i spredningen av COVID-19 i Nord-Italia?, BMJ Rapid Responses, 8. april 2020, tilgjengelig på: https://www.bmj.com/content/368/bmj.m1103/rapid-responses
7. Sedlmaier, N., Hoppenheidt, K., Krist, H., Lehmann, S., Lang, H., Buttner, M. Generering av aviært influensavirus (AIV) kontaminert fecal fine particulate matter (PM2.5): genom- og smittepåvisning og beregning av immisjon.Veterinær mikrobiologi.139, 156-164 (2009)
8. Zhao, Y., Richardson, B., Takle, E., Chai, L., Schmitt, D., Win, H. Luftbåren overføring kan ha spilt en rolle i spredningen av høypatogene aviær influensautbrudd i 2015 i Forente stater.Sci Rep. 9, 11755. https://doi.org/10.1038/s41598-019-47788-z (2019)
9. Ma, Y., Zhou, J., Yang, S., Zhao, Y., Zheng, X. Vurdering for virkningen av støvhendelser på forekomst av meslinger i det vestlige Kina.Atmosfærisk miljø.157, 1-9 (2017)
10. Sorensen, JH, Mackay, DKJ, Jensen, C. Ø., Donaldson, AI En integrert modell for å forutsi atmosfærisk spredning av munn- og klovsykevirus Epidemiol.Infect., 124, 577–590 (2000)
11. Glostera, J., Alexandersen, S. Nye retninger: luftbåren overføring av munn- og klovsykevirus atmosfærisk miljø, 38 (3), 503-505 (2004)
12. Reche, I., D'Orta, G., Mladenov, N., Winget, DM, Suttle, CA Avsetningshastigheter av virus og bakterier over det atmosperiske grenselaget.ISME Journal.12, 1154-1162 (2018)
13. Qin, N., Liang, P., Wu, C., Wang, G., Xu, Q., Xiong, X., Wang, T., Zolfo, M., Segata, N., Qin, H. ., Knight, R., Gilbert, JA, Zhu, TF Longitudinell undersøkelse av mikrobiom assosiert med svevestøv i en megaby.Genombiologi.21, 55 (2020)
14. Zhao, Y., Richardson, B., Takle, E., Chai, L., Schmitt, D., Win, H. Luftbåren overføring kan ha
spilte en rolle i spredningen av høypatogene aviær influensa-utbrudd i 2015 i USA.Sci
Rep. 9, 11755. https://doi.org/10.1038/s41598-019-47788-z (2019)
15. Ma, Y., Zhou, J., Yang, S., Zhao, Y., Zheng, X. Vurdering for virkningen av støvhendelser på forekomst av meslinger i det vestlige Kina.Atmosfærisk miljø.157, 1-9 (2017)
16. Jiang, W., Laing, P., Wang, B., Fang, J., Lang, J., Tian, G., Jiang, J., Zhu, TF Optimalisert DNA-ekstraksjon og metagenomisk sekvensering av luftbårne mikrobielle samfunn .Nat.Protoc.10, 768-779 (2015)
17. Pan, M., Lednicky, JA, Wu, C.-Y., Innsamling, partikkelstørrelse og påvisning av luftbårne virus.Journal of Applied Microbiology, 127, 1596-1611 (2019)
18. Zymoresearch Ldt, produktbeskrivelse, tilgjengelig på: https://www.zymoresearch.com/products/quick-rnafecal-soil-microbe microprep-kit
19. Quantabio Ltd, beskrivelse av produktet, tilgjengelig på: https://www.quantabio.com/qscript-xlt-1-steprt-qpcr-toughmix
20. Corman, VM, Landt, O., Kaiser, M., Molenkamp, R., Meijer, A., Chu, DK, & Mulders, DG (2020).
Påvisning av 2019 nytt koronavirus (2019-nCoV) ved sanntids RT-PCR.Eurosurveillance, 25(3), tilgjengelig på:.https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6988269/
Opprinnelig: https://doi.org/10.1101/2020.04.15.20065995
Innleggstid: 18. april 2020