Известно, что тяжелый острый респираторный синдром, известный как болезнь COVID-19, вызванный вирусом SARS-CoV-2, распространяется воздушно-капельным путем и при тесных контактах.[1]Бремя COVID-19 было чрезвычайно тяжелым в Ломбардии и долине реки По (Северная Италия)[2], районе, характеризующемся высокой концентрацией твердых частиц, которые, как уже известно, оказывают негативное воздействие на здоровье человека[3].Региональные данные, доступные для Италии на дату 12 апреля, показывают, что около 30% в настоящее время положительных людей все еще живут в Ломбардии (около 40%, если учитывать общее количество случаев, подтвержденных с начала эпидемии), за которыми следует Эмилия-Романья (13,5%). , Пьемонт (10,5%) и Венето (10%).[2]На эти четыре региона долины реки По приходится 80% всех смертей, зарегистрированных в Италии, и 65% госпитализаций в отделения интенсивной терапии.[2]
Исследование, проведенное Гарвардской школой общественного здравоохранения, по-видимому, подтверждает связь между повышением концентрации ТЧ и уровнем смертности из-за COVID-19 в США[4]. вирус может присутствовать на твердых частицах (ТЧ) во время распространения инфекции [5,6], что согласуется с уже имеющимися данными.
доступны для других вирусов.[7-15] Однако проблема переносимого по воздуху PM-ассоциированного микробиома, особенно в городской среде, остается в значительной степени недостаточно изученной,[16] и – в настоящее время – никто еще не проводил экспериментальных исследований, специально направленных на при подтверждении или исключении наличия SARS-CoV-2 на ПМ.
Здесь мы представляем первые результаты анализов, которые мы выполнили на 34 пробах PM10 наружных/воздушных PM10 с промышленной площадки в провинции Бергамо, собранных с помощью двух разных пробоотборников воздуха в течение непрерывного трехнедельного периода, с 21 февраля по март. 13-й.
Следуя методологии, описанной Pan et al.в 2019 г. (для сбора, определения размера частиц и обнаружения переносимых по воздуху вирусов)[17] образцы ТЧ были собраны на фильтрах из кварцевого волокна с использованием гравиметрического пробоотборника малого объема (38,3 л/мин в течение 23 ч) в соответствии с эталонным методом EN12341. :2014 для мониторинга PM10.Твердые частицы улавливались фильтрами с типичным показателем 99,9%.удерживание аэрозоля, должным образом хранящиеся и доставленные в лабораторию прикладной и сравнительной геномики Университета Триеста.Учитывая «экологический» характер образца, предположительно богатого ингибиторами ДНК-полимераз, мы приступили к выделению РНК с использованием набора фекальных почвенных микробов Quick RNA, адаптированного к типу фильтров.[18]Половина фильтра была свернута, с верхней стороной внутрь,в полипропиленовой тубе объемом 5 мл вместе с гранулами, входящими в комплект.Из исходного 1 мл лизирующего буфера мы смогли получить около 400 мкл раствора, который затем обработали в соответствии со стандартными протоколами, в результате чего конечный элюат составил 15 мкл.Впоследствии 5 мкл использовали для тестирования на SARS-CoV-2.Учитывая особое происхождение образца, был использован qScript XLT 1-Step RT-qPCR ToughMix.[19]Системы амплификации соответствовали протоколу, разработанному Corman et al. и опубликованному на веб-сайте ВОЗ [20].
Тест был явно направлен на подтверждение или исключение присутствия РНК SARS-CoV-2 на твердых частицах.Первый анализ использовал «ген Е» в качестве молекулярного маркера и дал впечатляющий положительный результат на 15 из 16 фильтров, даже если, как мы могли ожидать, Ct был между 36-38 циклами.
После этого мы повторили анализ на 6 положительных фильтрах (уже положительных на «ген E»), используя «ген RtDR» в качестве молекулярного маркера, который является высокоспецифичным для SARS-CoV-2, и получили 5 значимых результатов. позитива;также были успешно проведены контрольные тесты для исключения ложноположительных результатов (рис. 1).
Чтобы избежать исчерпания дефицитного доступного материала для отбора проб, оставшиеся выделенные РНК были доставлены в местную университетскую больницу (один из клинических центров, уполномоченных правительством Италии на диагностические тесты на SARS-CoV-2), для проведения второго исследования. параллельный слепой тест.Эта вторая клиническая лаборатория протестировала 34 экстракта РНК для генов E, N и RdRP, сообщив о 7 положительных результатах, по крайней мере, для одного из трех маркерных генов, при этом положительность подтверждена отдельно для всех трех маркеров (рис. 2).Из-за характера пробы и с учетом того, что отбор проб проводился не для целей клинической диагностики, а для испытаний на загрязнение окружающей среды (принимая во внимание также то, что фильтры хранились не менее четырех недель перед проведением молекулярно-генетических анализов, т.к.после закрытия в Италии), мы можем подтвердить, что обоснованно продемонстрировали наличие вирусной РНК SARS-CoV-2, обнаружив высокоспецифичный «ген RtDR» на 8 фильтрах.Однако из-за отсутствия дополнительных материалов из фильтров мы не смогли повторить достаточное количество тестов, чтобы одновременно показать положительный результат по всем трем молекулярным маркерам.
Это первое предварительное доказательство того, что РНК SARS-CoV-2 может присутствовать в твердых частицах вне помещений, что позволяет предположить, что в условиях стабильной атмосферы и высоких концентраций ТЧ SARS-CoV-2 может образовывать кластеры с ТЧ на открытом воздухе и – за счет снижая их коэффициент диффузии – усиливают персистенцию вируса в атмосфере.Дальнейшие подтверждения этого предварительногодоказательства продолжаются и должны включать оценку в режиме реального времени жизнеспособности SARS-CoV-2, а также его вирулентности при адсорбции на твердых частицах.В настоящее время нельзя сделать никаких предположений относительно корреляции между присутствием вируса на ПМ и прогрессированием вспышки COVID-19.Другими вопросами, требующими особого внимания, являются средние концентрации ТЧ в конечном итоге.требуется для потенциального «буст-эффекта» заражения (в случае подтверждения того, что ТЧ могут действовать как «переносчик» для вирусных капельных ядер), или даже теоретической возможности иммунизации в результате воздействия минимальной дозы при более низких порогах ТЧ .
Рис.1 Кривые амплификации генов Е (А) и RdRP (Б): зеленые линии – тестируемые фильтры;перекрестные линиипредставляет выборки эталонного фильтра;красные линии представляют усиление положительных образцов.
Рис.2.Положительные результаты (отмечены X) для генов E, N и RdRP, полученные для всех 34 образцов PM10.фильтры, протестированные во втором параллельном анализе.
Леонардо Сетти1, Фабрицио Пассарини2, Джанлуиджи Де Дженнаро3, Пьерлуиджи Барбьери4, Мария Грация Перроне5, Массимо Борелли6, Йоланда Пальмисани3, Алессия Ди Хилио3, Валентина Торболи6, Альберто Паллавичини6, Маурицио Русцио7, Приско Пискителли8, Алессандро Миани8,9
1. Кафедра промышленной химии, Болонский университет, Viale del Risorgimento – 4, I-40136, Болонья, Италия
e-mail: leonardo.setti@unibo.it
2. Межведомственный центр промышленных исследований «Возобновляемые источники, окружающая среда, голубой рост, энергетика»,
University of Bologna, Rimini, Italy e-mail: fabrizio.passarini@unibo.it
3. Кафедра биологии, Университет «Альдо Моро» в Бари, Бари, Италия
e-mail: gianluigi.degennaro@uniba.it; alessia.digilio@uniba.it; jolanda.palmisani@uniba.it
4. Кафедра химических и фармацевтических наук, Университет Триеста, Триест, Италия
e-mail: barbierp@units.it
5. Отдел экологических исследований, TCR TECORA, Милан, Италия
e-mail: mariagrazia.perrone@tcrtecora.com
6. Кафедра наук о жизни – Университет Триеста, Триест, Италия
e-mail: borelli@units.it; torboli@units.it; pallavic@units.it
7. Отделение лабораторной медицины, Университетская клиника Джулиано Изонтина (ASU GI), Триест, Италия
email: maurizio.ruscio@asugi.sanita.fvg.it
8. Итальянское общество экологической медицины (SIMA), Милан, Италия
e-mail: priscofreedom@hotmail.com; alessandro.miani@unimi.it
9. Кафедра экологических наук и политики, Миланский университет, Милан, Италия
e-mail: priscofreedom@hotmail.com; alessandro.miani@unimi.it
Соответствующий автор:
Леонардо Сетти, Department of Industrial Chemistry, University of Bologna Viale del Risorgimento 4, 40136, Bologna, Italy; e-mail: leonardo.setti@unibo.it
Рекомендации
1. Всемирная организация здравоохранения, Пути передачи вируса, вызывающего COVID-19: последствия для рекомендаций по мерам предосторожности ПИИК, Научная справка;доступно по ссылке: https://www.who.int/newsroom/commentaries/detail/modes-of-transmission-of-virus-causing-covid-19-implications-for-ipcprecaution-recommendations (29 марта 2020 г.)
2. Министерство здравоохранения Италии, ежедневный бюллетень «Вспышка Covid-19 в Италии», доступный на http://www.salute.gov.it/imgs/C_17_notizie_4451_0_file.pdf.
3. ЕАОС, Европейское агентство по охране окружающей среды, Отчет о качестве воздуха в Европе, 2019 г.;№ 10/2019;Европейское агентство по окружающей среде: Копенгаген, Дания, доступно по адресу: https://www.eea.europa.eu/publications/airquality-in-europe-2019
4. Xiao Wu, Rachel C. Nethery, M. Benjamin Sabath, Danielle Braun, Francesca Dominici, Воздействие загрязнения воздуха и смертность от COVID-19 в Соединенных Штатах, доступно по адресу: https://projects.iq.harvard.edu/ files/covid-pm/files/pm_and_covid_mortality.pdf
5. Итальянское общество экологической медицины (SIMA), позиционный документ по твердым частицам и COVID-19,
доступно по адресу: http://www.simaonlus.it/wpsima/wp-content/uploads/2020/03/COVID_19_positionpaper_ENG.pdf
6. Сетти Л., Пассарини Ф., Де Дженнаро Г., Барбьери П., Перроне М.Г., Пьяццалунга А., Борелли М., Пальмисани Дж., Ди Хилио А., Писцителли П., Миани А., Есть ли правдоподобная роль для твердых частиц при распространении COVID-19 в Северной Италии?, BMJ Rapid Responses, 8 апреля 2020 г., доступно по адресу: https://www.bmj.com/content/368/bmj.m1103/rapid-responses.
7. Седлмайер, Н., Хоппенхайдт, К., Крист, Х., Леманн, С., Ланг, Х., Бюттнер, М. Образование мелкодисперсных частиц фекалий, зараженных вирусом птичьего гриппа (ВГП) (PM2,5): определение генома и инфекционности и расчет иммиссии.Ветеринарная микробиология.139, 156-164 (2009)
8. Чжао Ю., Ричардсон Б., Такле Э., Чай Л., Шмитт Д., Вин Х. Возможна передача воздушно-капельным путем в распространении в 2015 г. вспышек высокопатогенного птичьего гриппа в Соединенные Штаты.Научный отчет 9, 11755. https://doi.org/10.1038/s41598-019-47788-z (2019)
9. Ma, Y., Zhou, J., Yang, S., Zhao, Y., Zheng, X. Оценка воздействия пыли на заболеваемость корью в западном Китае.Атмосферная среда.157, 1-9 (2017)
10. Соренсен Дж. Х., Маккей Д. К. Дж., Дженсен С. О., Дональдсон А. И. Интегрированная модель для прогнозирования атмосферного распространения вируса ящура Epidemiol.Заразить., 124, 577–590 (2000).
11. Глостера Дж., Александерсен С. Новые направления: воздушно-капельная передача вируса ящура в атмосферную среду, 38 (3), 503-505 (2004)
12. Реш И., Д'Орта Г., Младенов Н., Уингет Д.М., Саттл К.А. Скорость осаждения вирусов и бактерий над атмосферным пограничным слоем.Журнал ISME.12, 1154-1162 (2018)
13. Цинь, Н., Лян, П., Ву, К., Ван, Г., Сюй, Q., Сюн, X., Ван, Т., Зольфо, М., Сегата, Н., Цинь, Х. ., Knight, R., Gilbert, JA, Zhu, TF Продольное исследование микробиома, связанного с твердыми частицами в мегаполисе.Геномная биология.21, 55 (2020)
14. Чжао Ю., Ричардсон Б., Такле Э., Чай Л., Шмитт Д., Вин Х. Возможна передача воздушно-капельным путем.
сыграл роль в распространении вспышек высокопатогенного птичьего гриппа в США в 2015 г.наука
Отчет 9, 11755. https://doi.org/10.1038/s41598-019-47788-z (2019)
15. Ma, Y., Zhou, J., Yang, S., Zhao, Y., Zheng, X. Оценка воздействия пыли на заболеваемость корью в западном Китае.Атмосферная среда.157, 1-9 (2017)
16. Jiang, W., Laing, P., Wang, B., Fang, J., Lang, J., Tian, G., Jiang, J., Zhu, TF. Оптимизированная экстракция ДНК и метагеномное секвенирование микробных сообществ, находящихся в воздухе. .Нац.протокол10, 768-779 (2015)
17. Пан М., Ледницки Дж. А., Ву С.-Ю. Сбор, определение размера частиц и обнаружение вирусов, передающихся по воздуху.Журнал прикладной микробиологии, 127, 1596-1611 (2019)
18. Zymoresearch Ldt, описание продукта, доступно по адресу: https://www.zymoresearch.com/products/quick-rnafecal-soil-microbe microprep-kit.
19. Quantabio Ltd, описание продукта доступно по адресу: https://www.quantabio.com/qscript-xlt-1-steprt-qpcr-toughmix.
20. Корман В.М., Ландт О., Кайзер М., Моленкамп Р., Мейер А., Чу Д.К. и Малдерс Д.Г. (2020).
Обнаружение нового коронавируса 2019 года (2019-nCoV) методом ОТ-ПЦР в реальном времени.Eurosurveillance, 25(3), доступно по адресу: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6988269/
Оригинал: https://doi.org/10.1101/2020.04.15.20065995
Время публикации: 18 апреля 2020 г.