Je známe, že závažný akútny respiračný syndróm známy ako ochorenie COVID-19 – spôsobený vírusom SARS-CoV-2 – sa šíri kvapôčkami z dýchacích ciest a blízkymi kontaktmi.[1]Záťaž COVID-19 bola mimoriadne vážna v Lombardii a Pádskej nížine (severné Taliansko),[2] v oblasti charakterizovanej vysokými koncentráciami pevných častíc, o ktorých je už známe, že majú negatívne účinky na ľudské zdravie.[3]Regionálne údaje dostupné pre Taliansko k dátumu 12. apríla ukazujú, že približne 30 % v súčasnosti pozitívnych ľudí stále žije v Lombardii (asi 40 %, ak vezmeme do úvahy celkový počet prípadov potvrdených od začiatku epidémie), po ktorej nasleduje Emilia Romagna (13,5 %) , Piemont (10,5 %) a Veneto (10 %).[2]Tieto štyri regióny Pádskej nížiny predstavujú 80 % celkových úmrtí zaznamenaných v Taliansku a 65 % prijatých na jednotky intenzívnej starostlivosti.[2]
Zdá sa, že výskum, ktorý uskutočnila Harvard School of Public Health, potvrdzuje súvislosť medzi zvýšením koncentrácie PM a mierou úmrtnosti v dôsledku COVID-19 v USA[4] V predchádzajúcich oznámeniach sme predpokladali možnosť, že SARS-CoV-2 vírus by mohol byť prítomný na časticiach (PM) počas šírenia infekcie,[5,6] v súlade s už existujúcimi dôkazmi
dostupné pre iné vírusy.[7-15] Problematika mikrobiómov spojených s PM vo vzduchu, najmä v mestskom prostredí, však zostáva do značnej miery nedostatočne preskúmaná[16] a – v súčasnosti – ešte nikto neuskutočnil experimentálne štúdie špecificky zamerané pri potvrdení alebo vylúčení prítomnosti SARS-CoV-2 na PM.
Tu uvádzame prvé výsledky analýz, ktoré sme vykonali na 34 vzorkách PM10 vonkajších/vzduchových PM10 z priemyselnej lokality v provincii Bergamo, zozbieraných dvoma rôznymi zariadeniami na odber vzoriek vzduchu počas nepretržitého 3-týždňového obdobia, od 21. februára do marca. 13.
Podľa metodológie opísanej Panom a kol.v roku 2019 (na odber, určovanie veľkosti častíc a detekciu vzdušných vírusov)[17] vzorky PM boli odoberané na filtroch z kremenných vlákien pomocou nízkoobjemového gravimetrického vzorkovača vzduchu (38,3 l/min počas 23 h), v súlade s referenčnou metódou EN12341 :2014 pre monitorovanie PM10.Častice boli zachytené na filtroch s typickým 99,9 %.zadržiavanie aerosólu, správne uskladnené a doručené do laboratória aplikovanej a porovnávacej genomiky univerzity v Terste.Vzhľadom na „environmentálny“ charakter vzorky, pravdepodobne bohatej na inhibítory DNA polymeráz, sme pristúpili k extrakcii RNA pomocou súpravy fekálnych pôdnych mikróbov Quick RNA prispôsobenej typu filtrov.[18]Polovičný filter bol zrolovaný tak, aby horná strana smerovala dovnútra,v 5 ml polypropylénovej skúmavke spolu s guľôčkami dodanými v súprave.Z počiatočného 1 ml lyzačného pufra sme boli schopní získať asi 400 ul roztoku, ktorý bol potom spracovaný podľa štandardných protokolov, výsledkom čoho bol konečný eluát 15 ul.Následne sa 5 ul použilo na testovanie SARS-CoV-2.Vzhľadom na konkrétny pôvod vzorky bol použitý qScript XLT 1-Step RT-qPCR ToughMix.[19]Amplifikačné systémy boli podľa protokolu vyvinutého Cormanom a kol., publikovaného na webovej stránke WHO [20].
Test bol výslovne zameraný na potvrdenie alebo vylúčenie prítomnosti RNA SARS-CoV-2 na časticiach.Prvá analýza použila „E gén“ ako molekulárny marker a priniesla pôsobivý pozitívny výsledok na 15 zo 16 filtrov, aj keď, ako sme mohli očakávať, Ct bola medzi 36-38 cyklami.
Potom sme replikovali analýzu na 6 pozitívnych filtroch (už pozitívnych na „gén E“) pomocou „génu RtDR“ ako molekulárneho markera – ktorý je vysoko špecifický pre SARS-CoV-2 – a dosiahli sme 5 významných výsledkov. pozitivity;úspešne boli vykonané aj kontrolné testy na vylúčenie falošnej pozitivity (obr. 1).
Aby sa predišlo vyčerpaniu dostupného vzácneho materiálu na odber vzoriek, zvyšné extrahované RNA boli doručené do miestnej univerzitnej nemocnice (jedno z klinických centier autorizovaných talianskou vládou na diagnostické testy SARS-CoV-2), aby sa vykonalo druhé. paralelný slepý test.Toto druhé klinické laboratórium testovalo 34 extrakcií RNA pre gény E, N a RdRP, pričom uviedlo 7 pozitívnych výsledkov pre aspoň jeden z troch markerových génov, pričom pozitivita bola potvrdená samostatne pre všetky tri markery (obr. 2).Vzhľadom na povahu vzorky a vzhľadom na to, že odber vzoriek nebol vykonaný na klinické diagnostické účely, ale na testy znečistenia životného prostredia (berúc do úvahy aj to, že filtre boli pred molekulárno-genetickými analýzami skladované najmenej štyri týždne, pretožev dôsledku talianskeho vypnutia) môžeme potvrdiť, že sme primerane preukázali prítomnosť vírusovej RNA SARS-CoV-2 detekciou vysoko špecifického „génu RtDR“ na 8 filtroch.Avšak kvôli nedostatku ďalších materiálov z filtrov sme neboli schopní zopakovať dostatočný počet testov, aby sme ukázali pozitivitu pre všetky 3 molekulárne markery súčasne.
Toto je prvý predbežný dôkaz, že SARS-CoV-2 RNA môže byť prítomná na vonkajších časticiach, čo naznačuje, že v podmienkach atmosférickej stability a vysokých koncentrácií PM by SARS-CoV-2 mohol vytvárať zhluky s vonkajšími PM a – zníženie ich difúzneho koeficientu – zvýšenie perzistencie vírusu v atmosfére.Ďalšie potvrdenia tohto predbežnéhodôkazy prebiehajú a mali by zahŕňať hodnotenie životaschopnosti SARS-CoV-2 v reálnom čase, ako aj jeho virulencie, keď je adsorbovaný na častice.V súčasnosti nie je možné urobiť žiadne predpoklady týkajúce sa korelácie medzi prítomnosťou vírusu na PM a progresiou prepuknutia COVID-19.Ďalšími otázkami, ktoré je potrebné konkrétne riešiť, sú prípadne priemerné koncentrácie PMpotrebný pre potenciálny „posilňujúci účinok“ nákazy (v prípade, že sa potvrdí, že PM môže pôsobiť ako „nosič“ jadier vírusových kvapôčok), alebo dokonca teoretická možnosť imunizácie v dôsledku vystavenia minimálnej dávke pri nižších prahoch PM .
Obr. 1 Amplifikačné krivky génov E (A) a RdRP (B): zelené čiary predstavujú testované filtre;krížové čiarypredstavuje referenčné filtračné extrakcie;červené čiary predstavujú amplifikáciu pozitívnych vzoriek.
Obr.2.Pozitívne výsledky (označené X) pre gény E, N a RdRP získané pre celú vzorku 34 PM10filtre testované v druhej paralelnej analýze.
Leonardo Setti1, Fabrizio Passarini2, Gianluigi De Gennaro3, Pierluigi Barbieri4, Maria Grazia Perrone5, Massimo Borelli6, Jolanda Palmisani3, Alessia Di Gilio3, Valentina Torboli6, Alberto Pallavicini6, Maurizio Ruscio7, Prisco A Piscitelli8, Prisco A Piscitelli8
1. Katedra priemyselnej chémie, Univerzita v Bologni, Viale del Risorgimento – 4, I-40136, Bologna, Taliansko
e-mail: leonardo.setti@unibo.it
2. Medzirezortné centrum pre priemyselný výskum „Obnoviteľné zdroje, životné prostredie, modrý rast, energia“,
University of Bologna, Rimini, Italy e-mail: fabrizio.passarini@unibo.it
3. Katedra biológie, Univerzita „Aldo Moro“ v Bari, Bari, Taliansko
e-mail: gianluigi.degennaro@uniba.it; alessia.digilio@uniba.it; jolanda.palmisani@uniba.it
4. Katedra chemických a farmaceutických vied, Univerzita v Terste, Terst, Taliansko
e-mail: barbierp@units.it
5. Divízia environmentálneho výskumu, TCR TECORA, Miláno, Taliansko
e-mail: mariagrazia.perrone@tcrtecora.com
6. Katedra prírodných vied – Univerzita v Terste, Terst, Taliansko
e-mail: borelli@units.it; torboli@units.it; pallavic@units.it
7. Divízia laboratórnej medicíny, Univerzitná nemocnica Giuliano Isontina (ASU GI), Terst, Taliansko
email: maurizio.ruscio@asugi.sanita.fvg.it
8. Talianska spoločnosť environmentálnej medicíny (SIMA), Miláno, Taliansko
e-mail: priscofreedom@hotmail.com; alessandro.miani@unimi.it
9. Katedra environmentalistiky a poicy, Univerzita v Miláne, Miláno, Taliansko
e-mail: priscofreedom@hotmail.com; alessandro.miani@unimi.it
Zodpovedajúci Autor:
Leonardo Setti, Department of Industrial Chemistry, University of Bologna Viale del Risorgimento 4, 40136, Bologna, Italy; e-mail: leonardo.setti@unibo.it
Referencie
1. Svetová zdravotnícka organizácia, Spôsoby prenosu vírusu spôsobujúceho COVID-19: dôsledky pre preventívne odporúčania IPC, Vedecká informácia;k dispozícii na: https://www.who.int/newsroom/commentaries/detail/modes-of-transmission-of-virus-causing-covid-19-implications-for-ipcprecaution-recommendations (29. marca 2020)
2. Talianske ministerstvo zdravotníctva, denný bulletin prepuknutia Covid-19 v Taliansku, dostupný na http://www.salute.gov.it/imgs/C_17_notizie_4451_0_file.pdf
3. EEA, Európska environmentálna agentúra, Správa o kvalite ovzdušia v Európe 2019;č. 10/2019;Európska environmentálna agentúra: Kodaň, Dánsko, dostupné na: https://www.eea.europa.eu/publications/airquality-in-europe-2019
4. Xiao Wu, Rachel C. Nethery, M. Benjamin Sabath, Danielle Braun, Francesca Dominici, Vystavenie znečisteniu ovzdušia a úmrtnosť na COVID-19 v Spojených štátoch, dostupné na: https://projects.iq.harvard.edu/ files/covid-pm/files/pm_and_covid_mortality.pdf
5. Talianska spoločnosť pre environmentálnu medicínu (SIMA), Position Paper Particulate Matter a COVID-19,
dostupné na: http://www.simaonlus.it/wpsima/wp-content/uploads/2020/03/COVID_19_positionpaper_ENG.pdf
6. Setti L., Passarini F., De Gennaro G., Barbieri P., Perrone MG, Piazzalunga A., Borelli M., Palmisani J., Di Gilio A, Piscitelli P, Miani A., Existuje hodnoverná úloha pre častice pri šírení COVID-19 v severnom Taliansku?, BMJ Rapid Responses, 8. apríla 2020, dostupné na: https://www.bmj.com/content/368/bmj.m1103/rapid-responses
7. Sedlmaier, N., Hoppenheidt, K., Krist, H., Lehmann, S., Lang, H., Buttner, M. Generácia vírusom vtáčej chrípky (AIV) kontaminovaná fekálnymi jemnými časticami (PM2,5): detekcia genómu a infekčnosti a výpočet imisií.Veterinárna mikrobiológia.139, 156-164 (2009)
8. Zhao, Y., Richardson, B., Takle, E., Chai, L., Schmitt, D., Win, H. Prenos vzduchom mohol zohrať úlohu pri šírení prepuknutia vysoko patogénnej vtáčej chrípky v roku 2015 v Spojené štáty.Sci Rep. 9, 11755. https://doi.org/10.1038/s41598-019-47788-z (2019)
9. Ma, Y., Zhou, J., Yang, S., Zhao, Y., Zheng, X. Hodnotenie vplyvu prachových udalostí na výskyt osýpok v západnej Číne.Atmosférické prostredie.157, 1-9 (2017)
10. Sorensen, JH, Mackay, DKJ, Jensen, C. Ø., Donaldson, AI Integrovaný model na predpovedanie atmosférického šírenia vírusu slintačky a krívačky Epidemiol.Infect., 124, 577-590 (2000)
11. Glostera, J., Alexandersen, S. New Directions: Airborne Transmission of Foot-and-Mouth Disease Virus Atmospheric Environment, 38 (3), 503-505 (2004)
12. Reche, I., D'Orta, G., Mladenov, N., Winget, DM, Suttle, CA Miera depozície vírusov a baktérií nad atmosférickou hraničnou vrstvou.časopis ISME Journal.12, 1154-1162 (2018)
13. Qin, N., Liang, P., Wu, C., Wang, G., Xu, Q., Xiong, X., Wang, T., Zolfo, M., Segata, N., Qin, H ., Knight, R., Gilbert, JA, Zhu, TF Pozdĺžny prieskum mikrobiómu spojeného s časticami v megacity.biológia genómu.21, 55 (2020)
14. Zhao, Y., Richardson, B., Takle, E., Chai, L., Schmitt, D., Win, H. Vzdušný prenos môže mať
zohral úlohu pri šírení prepuknutia vysoko patogénnej vtáčej chrípky v Spojených štátoch v roku 2015.Sci
Rep. 9, 11755. https://doi.org/10.1038/s41598-019-47788-z (2019)
15. Ma, Y., Zhou, J., Yang, S., Zhao, Y., Zheng, X. Hodnotenie vplyvu prachových udalostí na výskyt osýpok v západnej Číne.Atmosférické prostredie.157, 1-9 (2017)
16. Jiang, W., Laing, P., Wang, B., Fang, J., Lang, J., Tian, G., Jiang, J., Zhu, TF Optimalizovaná extrakcia DNA a metagenomické sekvenovanie vzdušných mikrobiálnych spoločenstiev .Nat.Protoc.10, 768-779 (2015)
17. Pan, M., Lednický, JA, Wu, C.-Y., Zber, veľkosť častíc a detekcia vzduchom prenášaných vírusov.Journal of Applied Microbiology, 127, 1596-1611 (2019)
18. Zymoresearch Ldt, popis produktu, dostupný na: https://www.zymoresearch.com/products/quick-rnafecal-soil-microbe microprep-kit
19. Quantabio Ltd, popis produktu, dostupný na: https://www.quantabio.com/qscript-xlt-1-steprt-qpcr-toughmix
20. Corman, VM, Landt, O., Kaiser, M., Molenkamp, R., Meijer, A., Chu, DK, & Mulders, DG (2020).
Detekcia nového koronavírusu z roku 2019 (2019-nCoV) pomocou RT-PCR v reálnom čase.Eurosurveillance, 25(3), dostupné na:.https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6988269/
Originál: https://doi.org/10.1101/2020.04.15.20065995
Čas odoslania: 18. apríla 2020